质粒构建-质粒构建的原理及方法

大家好，今天小编关注到一个比较有意思的话题，就是关于质粒构建的问题，于是小编就整理了4个相关介绍质粒构建的解答，让我们一起看看吧。

基因表达载体构建步骤？

基因表达载体构建的步骤如下：

1. 目的基因获取：在进行PCR之前，需要先针对自己的基因设计对应的引物；提取与所需表达的基因同源的细胞或组织中的RNA，并经过RT程序将其转化为cDNA；PCR扩增出所需要的基因片段。

2. 载体构建：载体构建（vector construction）是分子生物学研究常用的手段之一。依赖于限制性核酸内切酶、DNA连接酶和其它修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

3. 挑取克隆提质粒验证：挑取单菌落接种于含载体对应抗性的LB培养液中，200rpm，37℃恒温摇床培养过夜，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，再进行双酶切验证、测序验证。

构建步骤：

1、用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现缺口，露出黏性末端；

2、再用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端；

3、将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处；

4、再使碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键；

5、再加入适量的DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。

什么可以做质粒？

质粒载体可以作为质粒，它是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的质粒。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。

同源重组构建质粒原理及方法？

原理依赖于限制性核酸内切酶,DNA 连接酶和其他修饰酶的作用,分别对目的基因和载体 DNA 进行适当切割和修饰后,将二者连接在一起,再导入宿主细胞,实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

传统的构建重组质粒的方法为TA克隆。该方法需要将构建进载体的片段通过PCR技术引入合适的酶切位点扩增出来，随后与T载体进行连接。将连接好的质粒转化大肠杆菌进行扩增，随后对扩增好的质粒进行酶切，得到含有粘性末端的片段。将该片段与同样经过双酶切的载体进行连接，转化大肠杆菌后即可得到重组质粒。

质粒命名规则？

1. 小写p开头 ，p在这里指代质粒（pla***id），所以我们常常看到pXXXXX-XXXX。

2. 质粒骨架 p后面接上质粒骨架名称，pBACKBONE-XXXX。质粒骨架中包含promoter等等重要信息，一旦你对这个骨架熟悉，通过名称则很快能推测出质粒元件。addgene有专门的Vector Database可供查阅许多已发表或商业化的质粒空骨架信息。

3. 插入的基因名，pBACKBONE-hGene，可以看到h在这里的意思是human。在质粒命名中经常会用小写字母来代替物种，小鼠m，大鼠r等等。对于Cas9会写SpCas9，Sp则意为Streptococcus pyogenes （化脓性链球菌）。

4. 贴Tags，通常插入的基因还会带有flag，需要按照出现顺序给出信息，比如我们前面文章提到的NLS-Cas9-NLS，这意味着Cas9前后各有一个核定位信号NLS，以保证Cas9的和核定位。

5. 标记突变信息，插入的基因时常带有特定突变，因此需要额外标记出来。而突变通常使用氨基酸表示，

如Q295A代表：第295位谷氨酰胺（Glutamine）突变为丙氨酸 （Alanine）。以上是质粒命名的一些通用规则，有时候质粒不一定严格按照以上规则命名，但可以举一反三，窥得其中一些规律。

例子：

(1) pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)：以PX458为骨架，带有SpCas9表达元件，SpCas9后连接有2A-GFP元件，2A用于自我断裂，将Cas9和GFP分开，而GFP则作为筛选标记。

(2) px458_2A_GFP_sgRNA_TIAL1：以PX458为骨架（该骨架带有SpCas9），带有2A-GFP元件用于断裂和筛选，同时表达针对TIAL1基因的sgRNA，因此该质粒可用于TIAL1基因敲除，并且可使用GFP筛选。

(3) pLenti-U6sgbbB***bI-puro-2A-Fluc：慢病毒骨架质粒，带有U6启动子，奇怪名称sgbbB***bI（由于这是一个空骨架质粒，盲推这是酶切位点？）的sgRNA，筛选标记是puromycin，同时还会有荧光素酶表达用于体内成像。

到此，以上就是小编对于质粒构建的问题就介绍到这了，希望介绍关于质粒构建的4点解答对大家有用。