大家好,今天小编关注到一个比较有意思的话题,就是关于pcr试剂的问题,于是小编就整理了3个相关介绍pcr试剂的解答,让我们一起看看吧。
什么是PCR试剂?
PCR试剂简单的理解就是用于做PCR的试剂。实际做PCR的试剂很多,在这儿可以理解为达到PCR级别的试剂。试剂中不应该存在对PCR反应有影响的杂质。象核酸、核酸酶,如果是水的话,盐离子尽可能的小,最好是超纯水。象一些盐类,分析纯的就可以达到要求。如果想做PCR,买点TAQ酶,dNTP就够了,引物找公司合成,模板自己提取。
pcr检测需要哪些试剂?
PCR检测试剂就是PCR的反应体系,经典PCR以DNA为模板,其体系组成以下几方面:1.原始模板:微生物检验中将待测样本中的细菌或病毒DNA,作为扩增反应的原始模板;
2.引物:两段单链寡核苷酸,其序列与代扩增片段的两端分别相同和互补,作为DNA合成反应的引物;
3.原料:4种脱氧核苷酸三磷酸作为DNA合成的原料;
4.DNA聚合酶:催化DNA合成;
5.合适的盐、缓冲液以及温度循环参数。
荧光定量pcr试剂:通常有用sybrgreenmix做的,但是这里建议你用evagreen做,灵敏度和平行性都要好于sybrgreen,并且如果你那是abi或者stratagene的pcr如果用sybrgreen还需要加一步rox很麻烦。
PCR检测是指将微量DNA片段进行大量扩增,以便进行结构和功能分析。PCR即聚合酶链反应,其原理是在体外模拟体内DNA的***过程。
pcr反应体系配制详细操作过程?
1. 试剂准备阶段
试剂准备是 PCR 操作的第一个流程,需要在试剂贮存和准备区的超净工作台或生物安全柜进行,用确保无污染的移液器、枪头及容器等进行分装。所有的 PCR 体系都应该在 - 20℃ 保存,除了 ddH 2 O 之外,其余的试剂组份需完全融化之后再加入,以免影响浓度。配制反应体系应在快速进行,以减少非特异性扩增。体系配制完成之后应马上进行 PCR 反应。
2. 样本制备阶段
样本制备是整个 PCR 反应中最为关键的环节,在接收样本时一定要确保样本的密封性以及样本编号的唯一性。严格遵守操作规程进行加样操作,操作时候尽量少说话或者不说话。
所有操作需要在生物安全柜内进行,操作前后生物安全柜需要进行紫外灯消毒,注意生物安全柜中物品的排放。戴手套并勤于更换,要有「无核酸观念」 。
3. 核酸扩增
在核酸扩增环节需要选择质量好的 Ep 管,装入反应体系的 EP 管上机前混匀、离心,将管壁及管盖上的液体甩至管底部。在样本检测的同时设立对照(阳性对照、阴性对照、阴性模板、试剂对照)。同时严密检测 PCR 扩增仪的各项性能指标,其中对 PCR 扩增仪而言温度控制就意味着质量。
4. 产物分析
常见问题:
1)无 CT 值出现:模板量不足(杂质的引入及反复冻融的情况等)
2)CT 值出现过晚(大于 38):各种反应成分的降解或加样量的不足
3)标准曲线线性相关性不佳:加样误差、标准品出现降解等
4)阴性对照有信号:模板有基因组的污染
5)扩增效率低:反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解、反应抑制
6)扩增曲线的异常:模板的浓度太高或荧光染料的降解
四、实验室操作环境的维护
1) 各工作区要有一定的隔离,进入工作区域应按照单一的方向进行。试剂贮存和准备区 → 标本制备区 → PCR 扩增区 → 产物分析区单一方向进行。
2) 各个区域实验用品专用:各个区域实验设备和物品应有明确的标记,不能混用。
3) 实验场所要保持通风良好,严格监测各个工作区的温湿度。
4)注意实验室污染的预防。
整个 PCR 实验的操作都需要特别注意避免污染,来自样本的、试剂的以及实验室各种气溶胶,要始终保持「无核酸观念」。
到此,以上就是小编对于pcr试剂的问题就介绍到这了,希望介绍关于pcr试剂的3点解答对大家有用。
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